抗原特異性B細胞群體是發(fā)現(xiàn)治療性單克隆抗體（mAb）的關鍵資源，源自自然感染的人類或人工免疫后的動物（包括小鼠、大鼠、雞、兔和羊駝），這些細胞大多從供體血液樣本或免疫后的小鼠脾臟中分離。今天，小編將帶領大家一起深入探究這些常規(guī)單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)，了解它們是如何從實驗室走向世界的每一個角落，成為守護健康的強大武器。

雜交瘤技術(shù)

由1984年諾貝爾獎得主Cesar Milstein和Georges Kohler于1975年創(chuàng)立，成為了1986年美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）核準的第一個抗體Muromonab-CD3（商品名OKT3）的孵化搖籃。此技術(shù)的核心在于運用電融合法或化學介導的融合，使原初B細胞與骨髓瘤細胞（一種B細胞惡性腫瘤細胞系）結(jié)合，實現(xiàn)B細胞的永生化。雜交瘤技術(shù)的一個潛在缺點是細胞融合過程的效率有限。融合后，單個B細胞克隆通常通過有限的稀釋進行劃分。連續(xù)分泌IgG的克隆細胞允許對未純化的細胞上清進行中等通量篩選，以鑒定具有所需結(jié)合活性的克隆，例如，利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）進行親和性驗證。雜交瘤技術(shù)之所以吸引人是因為它保留下了原本的VH/VL配對，且在治療性抗體應用方面取得了成功?，F(xiàn)有多款出自雜交瘤的單克隆抗體獲得了FDA的認可，成為市場上的治療藥物。該技術(shù)主要用于小鼠、大鼠和兔子的B細胞永生化。為了鑒定全人抗體候選物，XenoMouse、HuMab-mouse和Alloy-GKmouse等轉(zhuǎn)基因小鼠模型也為傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)提供了有價值的B細胞來源，并分離出了經(jīng)FDA批準的單克隆抗體?？傮w而言，雜交瘤技術(shù)仍然是挖掘治療性IgG的常見和可靠途徑。

單B細胞篩選

單B細胞篩選作為雜交瘤技術(shù)的有力替代，標準化的篩選流程包括：B細胞首先通過磁珠分選（MACS）進行富集，根據(jù)細胞標記物標記抗原和抗體進行正性和負性選擇，確保僅選取那些表達了目標抗原或抗體的細胞。隨后，采用熒光激活細胞分選（FACS）技術(shù)，精確無誤地每孔一個細胞，為了提取并解析完整的VH/VL基因?qū)?，將細胞?nèi)的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）轉(zhuǎn)換成cDNA形式，再通過PCR針對性擴增VH與VL編碼區(qū)，生成足夠數(shù)量的基因模板，進行Sanger測序，優(yōu)選出的IgG隨即被克隆，表達，純化，最終篩選所需的生物學以及生物物理性質(zhì)。創(chuàng)新微流控技術(shù)更是讓單細胞水平的RT-PCR成為可能，一個流式細胞儀分選的抗原特異性B細胞池被劃分為每個微滴中的一個細胞，從而可以在微滴中進行小型化的RT-PCR，繼而通過二代測序和BCR分析篩檢候選抗體IgG。對比雜交瘤，單B細胞篩選省去了細胞融合環(huán)節(jié)，避免了每十萬細胞中只有一個存活分泌抗體B細胞的局限。

表面展示技術(shù)

除傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)和單B細胞篩選外，體外表面展示技術(shù)，特別是噬菌體和酵母展示，成為高通量篩選抗體片段的有力工具。

噬菌體展示：最早也是最廣泛應用的形式之一，利用噬菌體作為展示載體，將肽段或蛋白質(zhì)插入噬菌體外殼蛋白的基因中，使目的肽與噬菌體顆粒的表面展示出來。這一方法可用于篩選抗體、激酶抑制劑等。

酵母展示：使用釀酒酵母或其他真核微生物作為宿主，展示出來的蛋白質(zhì)更接近天然構(gòu)象，適合篩選具有復雜折疊和糖基化修飾的蛋白質(zhì)，如抗體。

細菌展示：通過改造細菌如大腸桿菌的膜蛋白，使目的蛋白在細胞表面表達，適用于高通量篩選和蛋白質(zhì)工程。

體外表面展示技術(shù)不僅適用于抗原經(jīng)驗豐富的抗體庫，還適用于原始抗體庫的篩選。后者的一個顯著優(yōu)點在于避免了構(gòu)建完整免疫應答所需耗時（數(shù)周乃至數(shù)月），這一點在應對傳染病時尤為重要。相比而言，從原始基因庫（>10^10變異體）中篩選，更能迅速獲取高親和力抗體。篩選大規(guī)模、多樣化的原始庫，分離出的克隆親和力通常與文庫規(guī)模呈正相關，顯示出在傳染病治療性抗體發(fā)現(xiàn)中的實用性，如針對SARS-CoV-2的情況所示。

相較于雜交瘤技術(shù)和單細胞篩選，表面展示技術(shù)因其易于進行多次循環(huán)篩選的特點，能有效精選出高親和力、高選擇性的克隆。多項FDA批準的單克隆抗體，如著名藥物Humira（阿達木單抗），正是得益于此類技術(shù)而得以發(fā)現(xiàn)。

從雜交瘤到單細胞技術(shù)，再到表面展示，每一階段都為抗體發(fā)現(xiàn)開辟新徑，促進免疫學研究與治療性抗體開發(fā)。