畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是近年來發(fā)展迅速、應用廣泛的一種真核表達系統。它是甲醇營養(yǎng)型酵母菌,有兩個乙醇氧化酶(Alcohol oxidase,AOX)編碼基因AOX1和AOX2,兩者序列相似,AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調控。當甲醇為唯一碳源時,AOX1啟動子可被甲醇誘導,啟動乙醇氧化酶的表達,從而用甲醇進行代謝,含AOX1啟動子的質??捎脕泶龠M編碼外源蛋白的目的基因的表達。
主要優(yōu)勢:
1.含有特有的強有力的AOX(醇氧化酶基因)啟動子,用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達
2.產物易分離,畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價,一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇,其余為無機鹽,培養(yǎng)基中不含蛋白,有利于下游產品分離純化
3.外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定,外源基因能以高拷貝數整合到畢赤酵母基因組中,不易丟失并能夠得到高表達菌株
4.作為真核表達系統,畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構,具有糖基化、脂肪?;?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能
表達菌株特點:
GS115:AOX1和AOX2基因都正常表達AOX蛋白(乙醇氧化酶),甲醇的利用效率高,接近于野生型,屬于甲醇快速利用型(Mut+)
KM71:AOX1基因被大部分剔除,只能利用AOX2為AOX編碼,甲醇利用速率變慢,表現為甲醇慢利用型(Muts)
外源基因的整合方式不同會導致表達菌株的表型不同:
Table 1. 酵母菌株表型
限制酶 | 插入位點 | GS115 表型 | KM71 表型 |
Sa1 I/StuI | HIS4 | HIS+Mut+ | HIS+Muts |
SacI | 5’AOX1 | HIS+Mut+ | HIS+Muts |
Bg1 II | 取代AOX1 | HIS+Muts | HIS+Muts |
Table 2. 表達載體信息
表達類型 | 載體名稱 | 篩選標記 | 啟動子 |
胞內表達 | pAO815 | HIS4 | AOX1 |
pPIC3K | HIS4 | AOX1 | |
pPIC3.5K | HIS4 | AOX1 | |
分泌表達 | pPICZα,A,B,C | bler | AOX1 |
pPIC9K | HIS4 | AOX1 |
對于胞外表達的蛋白除了可以用載體自帶的信號肽,還有以下信號肽可供選擇:
Table 3 . 信號肽序列
信號肽 | 蛋白序列 |
AlphaMF* | MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA |
Dse4 | MSFSSNVPQLFLLLVLLTNIVSG |
Exg1 | MNLYLITLLFASLCSA |
Scw11 | MLSTILNIFILLLFIQASLQ |
SAlb | MKWVTFISLLFLFSSAYS |