種類 | 研究對(duì)象 | 結(jié)合技術(shù) |
---|---|---|
染色質(zhì)免疫沉淀 (CHIP) |
DNA-蛋白質(zhì) | PCR |
蛋白質(zhì)免疫沉淀 (PIP) |
抗原-抗體 | 蛋白免疫印跡 |
放射免疫沉淀 (RIP) |
抗原-抗體 | 放射性同位素技術(shù) |
當(dāng)然,再結(jié)合其他技術(shù)還可以衍生出更多的技術(shù),本篇先來剖析一下染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)。
染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP) 是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。其原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。后期通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè),從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
應(yīng)用:ChIP可以用來檢測(cè)體內(nèi)反式作用因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且,ChIP與其他方法的結(jié)合擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍:ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選;ChIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合,用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn);RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。
甲醛處理細(xì)胞
收集細(xì)胞,超聲破碎
加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合
加入ProteinA,結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物,沉淀
對(duì)沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗,除去一些非特異性結(jié)合
洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物
解交聯(lián),純化富集的DNA-片斷
PCR或基因芯片分析
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翹首以待實(shí)驗(yàn)成果
然后有人歡喜有人憂
怎么把“驚嚇”變成“驚喜”
this is a question
只要找到破解方法,
所有的問題都不是問題!
今天我們就來一一擊破
免疫沉淀系列實(shí)驗(yàn)中那些揪心的問題。
原因 | 方案 |
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洗滌不充分 | 離心前蓋上管蓋反復(fù)顛倒幾次 |
抗體濃度太高 | 檢查推薦抗體用量,嘗試使用更少的抗體 |
抗體特異性不夠 | 使用親和純化的抗體,最好預(yù)先吸收 |
封閉不充分 | 優(yōu)化封閉時(shí)間/溫度,室溫封閉1小時(shí)或4℃封閉過夜 |
封閉液中與其他蛋白發(fā)生抗體的交叉反應(yīng) | 換一種不同的封閉液;不要用含抗生素蛋白的牛奶封閉,牛奶含生物素 |
操作設(shè)備被污染 | 保證電泳儀器、印跡儀器和孵育用容器清潔,無外源污染物 |
原因 | 方案 |
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蛋白未轉(zhuǎn)到膜上 | 可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠(考馬斯亮藍(lán))后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭;適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流 |
一抗、二抗等不匹配 | 選擇針對(duì)一抗來源的種屬抗體 |
過度封閉 | 使用含0.5%脫脂奶粉或無脫脂奶的抗體稀釋液;試用不同的封閉液;減少封閉時(shí)間 |
洗膜過度 | 洗膜時(shí)間不宜過長(zhǎng),加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多,建議使用0.05%的弱去垢劑Tween-20 |
曝光時(shí)間太短 | 延長(zhǎng)膠片的曝光時(shí)間,超感應(yīng)化學(xué)發(fā)光底物會(huì)持續(xù)發(fā)光至少6個(gè)小時(shí) |
原因 | 方案 |
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細(xì)胞傳代次數(shù)過多,蛋白表達(dá)模式分化 | 使用原始或傳代少的細(xì)胞株或進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn) |
樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解 |
使用新鮮制備的標(biāo)本并使用蛋白酶抑制劑;樣本處理時(shí)在冰上操作 |
一抗不純 | 使用單克隆或親和純化的抗體,減少非特異條帶 |
一抗特異性不高 | 重新選擇或制備高特異性的抗體 |
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