嗜肺軍團菌（legionella pneumophila，LP）是一類單極鞭毛革蘭陰性桿菌，能引發(fā)軍團病。LP可入侵人肺泡巨噬細胞，阻礙巨噬細胞自噬，躲避巨噬細胞對其徹底清除，并在巨噬細胞內(nèi)增殖，達到感染宿主的最終目標。LP 的脂多糖、菌毛、鞭毛等都與軍團菌的致病性相關(guān)，鞭毛蛋白是其重要的毒力因子，可加強病原菌的侵襲。
鞭毛蛋白是 Toll 樣受體 5（TLR5）的特異性配體，TLR5 作為模式識別受體，在致病菌侵襲宿主時，TLR5 依靠胞外的 LRR 蛋白結(jié)構(gòu)域（LRR domain）識別鞭毛蛋白，并觸發(fā)依賴髓樣分化因子 88（MyD88）的信號通路，激活微管相關(guān)蛋白激酶（microtubule -associated protein kinase，MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB）誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，有效清除病原體。

來自寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、銀川市第三人民醫(yī)院的研究人員在此前的研究中，使用LP 鞭毛重組蛋白A（rflaA）干預(yù)RAW264.7巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；?/font>6（histone deacetylase 6，HDAC6）增高。HDAC6是一種位于細胞質(zhì)的去乙酰化酶，參與多種生物過程的調(diào)控，包括自噬、熱休克反應(yīng)和腫瘤進展等。HDAC6還參與了線粒體吞噬和錯誤折疊蛋白向溶酶體和蛋白酶體的運輸。為了探究HDAC6在rflaA抑制巨噬細胞自噬中的作用，研究人員選擇 HDAC6-/-C57BL/6J 小鼠巨噬細胞作為此次實驗的研究對象。

采用支氣管肺泡灌洗法提取C57BL/6J與HDAC6-/-C57BL/6J兩種小鼠巨噬細胞，用小鼠巨噬細胞表面標記物F4/80鑒定；純化rflaA，CCK-8 法檢測其對小鼠巨噬細胞半數(shù)抑制濃度（IC50），篩選最佳作用濃度用于后續(xù)實驗；rflaA分別干預(yù)C57BL/6J 及HDAC6-/-C57BL/6J小鼠巨噬細胞6、12和24 h，RT-qPCR、Western blot 及免疫熒光檢測各組自噬相關(guān)因子自噬效應(yīng)蛋白1（Be－clin1）、自噬相關(guān)蛋白 5（ATG5）、自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈 3（LC3）、SQSTM1 蛋白（P62）的表達水平。

根據(jù)CCK-8結(jié)果計算，IC50為0.41 μg·μL-1，最佳作用濃度為0.041 μg·μL-1用于后續(xù)實驗；RT-qPCR、Westernblot、免疫熒光結(jié)果顯示，rflaA干預(yù)C57BL/6J小鼠巨噬細胞后，與0 h相比，6、12、24 h HDAC6的表達水平升高，LC3、ATG5表達水平均降低，P62的表達水平升高，Beclin1的表達水平先降低后升高（P 均＜0.05）；rflaA干預(yù)HDAC6-/-C57BL/6J小鼠巨噬細胞后，與0 h 相比，6、12、24 h LC3、ATG5、Beclin1表達水平均升高，P62的表達水平降低（P均＜0.05）；在相同的時間點，與C57BL/6J小鼠巨噬細胞各組相比，HDAC6敲除后各組細胞ATG5、LC3 表達水平升高，Beclin1先升高后降低，P62降低（P均＜0.05）。

小鼠巨噬細胞免疫熒光鑒定（免疫熒光染色×200）

 RT-qPCR 檢測敲除 HDAC6 對 rflaA 干預(yù)小鼠巨噬細胞不同時間點自噬相關(guān)因子 mRNA 表達的影響

Western blot 檢測敲除 HDAC6 對 rflaA 干預(yù)小鼠巨噬細胞不同時間點自噬相關(guān)因子蛋白表達的影響

LP rflaA干預(yù)C57BL/6J小鼠單核巨噬細胞后，能抑制其自噬，提示rflaA可能被TLR5識別，激活炎癥小體使巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)化的LC3脫脂，特異性地阻斷LC3-PE和ATG5相互作用，脫脂后的LC3未與溶酶體融合，從而阻斷自噬體-溶酶體途徑，LC3、ATG5的表達降低，吞噬體-溶酶體融合受損導(dǎo)致P62積累，積累的P62會與HDAC6結(jié)合通過泛素結(jié)合區(qū)來維持其去乙?；富钚?，導(dǎo)致α-tubulin的去乙?；?，P62通過維持HDAC6活性使微管不穩(wěn)定從而抑制自噬。
隨著時間發(fā)展，巨噬細胞的功能逐漸恢復(fù)，rflaA的抑制作用減弱，HDAC6 的活性開始恢復(fù)，表達水平升高，誘導(dǎo)表達的Be－clin1表達水平升高，Beclin1-PIK3C3復(fù)合體形成增多，自噬活性開始逐漸恢復(fù)。
HDAC6作為一種去乙酰化酶，當(dāng)HDAC6敲除后，rflaA對巨噬細胞自噬的抑制作用降低，巨
噬細胞乙?；饔迷鰪?，微管蛋白穩(wěn)定性增加，微管的運輸功能恢復(fù)，有助于恢復(fù)自噬通量，乙酰化酶P300乙?；揎?/font>LC3，導(dǎo)致LC3表達增加。細胞自噬途徑激活LC3表達上調(diào)后，自噬誘導(dǎo)Beclin1的乙?；饔迷鰪姡?/font>Beclin1乙?；軌虼龠M自噬體的成熟和降解，自噬小體和自噬溶酶體融合順暢，自噬作用增強，Beclin1表達升高。而LC3靶向自噬體膜是由ATG5 決定的，ATG5的表達也相應(yīng)升高。
HDAC6和P62作為泛素結(jié)合蛋白，參與自噬調(diào)控。HDAC6 催化從各種細胞質(zhì)蛋白中去除乙?；?，并包含一個泛素結(jié)合域，通過此結(jié)合域?qū)㈠e誤折疊和損壞的蛋白靶向到自噬小體中。當(dāng)細胞蛋白質(zhì)被破壞時，聚集體的形成就會發(fā)生。聚集體的形成是一種對錯誤折疊損傷蛋白的細胞保護反應(yīng)，并通過自噬誘導(dǎo)其清除。這些蛋白酶體與P62共定位，并通過選擇性巨自噬被清除，所以當(dāng)敲除HDAC6后，為了促進泛素聚集體和自噬降解，P62為了招募吞噬體膜上的LC3膜蛋白用于自噬體成熟，而自身被自噬降解，故自噬底物P62減少，P62的表達下調(diào)。

這充分表明，HDAC6 促進rflaA抑制小鼠巨噬細胞自噬，HDAC6可能通過影響微管蛋白乙酰化干擾巨噬細胞自噬。這項研究為HDAC6在rflaA干擾巨噬細胞自噬中的影響提供新的思路，為進一步了解HDAC6在LP鞭毛蛋白致病機制中的作用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻
ZHENG Ronghui,LI Pan,CAO Xiuqin,CHEN Minjia,CHEN Haixia,YANG Zhiwei.HDAC6 Regulates Flagellar Recombinant Protein A Interference Macrophage Autophagy[J].Ningxia Medical University,2023(06):573-580592.doi:10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2023.06.006