非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是一種由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)感染引起的以廣泛性出血為主要癥狀的急性高度接觸性烈性傳染病，發(fā)病率和死亡率高，最急性和急性型感染的死亡率可高達(dá)100%，目前尚無用于防治ASF的商業(yè)疫苗或藥物。

p72蛋白是ASFV最外層蛋白質(zhì)外殼的主要組成成分，約占病毒顆?？傎|(zhì)量的32%，在病毒感染晚期表達(dá)，參與ASFV結(jié)合和內(nèi)化入侵宿主細(xì)胞、病毒膜運(yùn)輸和遷移等過程。p72蛋白是檢測病毒時(shí)的主要抗原，由于其抗原性穩(wěn)定，常被用于血清學(xué)診斷。相對于抗體檢測，抗原檢測可更快速地檢出ASFV，比較常用的方法是雙抗體夾心Elisa法和膠體金免疫層析技術(shù)。

以純化的原核表達(dá)的p72重組蛋白作為抗原免疫3只Balb/c小鼠，共免疫3次，每次免疫間隔14d。隨后進(jìn)行小鼠血清抗體效價(jià)的檢測，當(dāng)免疫小鼠血清孔OD450值（P）/陰性小鼠血清孔OD450值(N)≥2.1時(shí)，判定所檢測物質(zhì)為陽性。取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合及陽性細(xì)胞株的篩選，，挑選出5株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并將其分泌的單克隆抗體分別進(jìn)行蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）鑒定、免疫熒光鑒定。隨后，鑒定５ 株雜交瘤細(xì)胞的單克隆抗體亞型，選擇其中效價(jià)水平較高的３株單克隆抗體進(jìn)行純化，對小鼠腹腔注射能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，1×10⁵個(gè)/只，以辛酸－硫酸銨法純化腹水中的單克隆抗體，采用微量紫外分光光度計(jì)測定濃度，再通過SDS-PAGE鑒定純化與未純化的單克隆抗體純度。

利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)可快速獲得大量重組蛋白，但由于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)修飾不完整，天然活性低，而真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白更接近于天然蛋白。這項(xiàng)研究中，在制備p72重組蛋白單克隆抗體時(shí)，以大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的p72重組蛋白作為免疫抗原對小鼠進(jìn)行免疫，再用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的p72重組蛋白進(jìn)行篩選，從而避免了假陽性結(jié)果，提高了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

通過重組蛋白表達(dá)技術(shù)制備ASFV的p72重組蛋白和使用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備抗p72蛋白的單克隆抗體，將純化后的單克隆抗體與p72兔源多克隆抗體組合并初步建立用于檢測p72抗原的雙抗體夾心Elisa方法，可以為建立快速、高效、便捷的檢測ASFV的方法提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

1. 謝林梅,唐子木,錢新杰等.非洲豬瘟病毒p72重組蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2023(13):5-11.DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2022.05.0097.
2. 楊曉紅.非洲豬瘟病毒P72基因單克隆抗體的制備及其重組桿狀病毒的構(gòu)建[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.DOI:10.7666/d.Y2161969.
3. 石正發(fā),馬源,袁洪,王由森,朱曉霞,車亮,李甲,羊倩倩,孫曉林.非洲豬瘟病毒p72蛋白單克隆抗體的制備及阻斷ELISA方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)報(bào),2023,45(5):488-493,547.DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.202210015.