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使用雜交瘤技術(shù)制備非洲豬瘟病毒p72重組蛋白單克隆抗體

發(fā)表時(shí)間:2024-01-09 訪問次數(shù):427

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是一種由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)感染引起的以廣泛性出血為主要癥狀的急性高度接觸性烈性傳染病,發(fā)病率和死亡率高,最急性和急性型感染的死亡率可高達(dá)100%,目前尚無用于防治ASF的商業(yè)疫苗或藥物

p72蛋白是ASFV最外層蛋白質(zhì)外殼的主要組成成分,約占病毒顆??傎|(zhì)量的32%,在病毒感染晚期表達(dá),參與ASFV結(jié)合和內(nèi)化入侵宿主細(xì)胞、病毒膜運(yùn)輸和遷移等過程。p72蛋白是檢測病毒時(shí)的主要抗原,由于其抗原性穩(wěn)定,常被用于血清學(xué)診斷。相對于抗體檢測,抗原檢測可更快速地檢出ASFV,比較常用的方法是雙抗體夾心Elisa法和膠體金免疫層析技術(shù)。

以純化的原核表達(dá)的p72重組蛋白作為抗原免疫3Balb/c小鼠,共免疫3次,每次免疫間隔14d。隨后進(jìn)行小鼠血清抗體效價(jià)的檢測,當(dāng)免疫小鼠血清孔OD450值(P/陰性小鼠血清孔OD450(N)2.1時(shí),判定所檢測物質(zhì)為陽性。取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合及陽性細(xì)胞株的篩選,,挑選出5株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,并將其分泌的單克隆抗體分別進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)鑒定、免疫熒光鑒定。隨后,鑒定5 株雜交瘤細(xì)胞的單克隆抗體亞型,選擇其中效價(jià)水平較高的3株單克隆抗體進(jìn)行純化,對小鼠腹腔注射能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,1×105個(gè)/只,以辛酸-硫酸銨法純化腹水中的單克隆抗體,采用微量紫外分光光度計(jì)測定濃度,再通過SDS-PAGE鑒定純化與未純化的單克隆抗體純度。


利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)可快速獲得大量重組蛋白,但由于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)修飾不完整,天然活性低,而真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白更接近于天然蛋白。這項(xiàng)研究中,在制備p72重組蛋白單克隆抗體時(shí),以大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的p72重組蛋白作為免疫抗原對小鼠進(jìn)行免疫,再用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的p72重組蛋白進(jìn)行篩選,從而避免了假陽性結(jié)果,提高了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

通過重組蛋白表達(dá)技術(shù)制備ASFVp72重組蛋白和使用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備抗p72蛋白的單克隆抗體,將純化后的單克隆抗體與p72兔源多克隆抗體組合并初步建立用于檢測p72抗原的雙抗體夾心Elisa方法,可以為建立快速、高效、便捷的檢測ASFV的方法提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

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